深圳子科生物ELISA试剂盒流程简单,实验结果准确,易操作,灵敏度高,准确度高,特异性强,精密度准,经济性省,安全性高等特点受到众多科研工作者的信赖与支持. 试剂盒应用:仅供科研研究实验使用,不能用于临床结果诊断,购买使用前请跟我司客服人员进行确认。保质期:6个月(我司所有ELISA试剂盒均会提供最新批次出库)。
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可用作 ELISA 测定的标本十分广泛,体液(如血清)、分泌物(唾液)和排泄物(如尿液)、 细胞培养上清、细胞、组织等均可作标本以测定其中某种成份。有些标本可直接进行测定,有些则需经预处理。
1)血清:
室温血液自然凝固 10-20 分钟后,离心 20 分钟左右( 2000-3000 转 / 分)。收集上清。如 有沉淀形成,应再次离心。
2)血浆:
应根据试剂盒的要求选择 EDTA 、柠檬酸钠或肝素作为抗凝剂,加入 10 %( v/v )抗凝剂 ( 0.1M 柠檬酸钠或 1% heparin 或 2.0%EDTA.Na2) 混合 10-20 分钟后,离心 20 分钟左右 ( 2000-3000 转 / 分)。仔细收集上清。如有沉淀形 成,应再次离心。
3)尿液、胸腹水、脑脊液:
用无菌管收集。离心 20 分钟左右( 2000-3000 转 / 分)。仔细收集上清。如有沉淀形成, 应再次离心。
4)细胞培养上清:
检测分泌性的成份时,用无菌管收集。离心 20 分钟左右( 2000-3000 转 / 分)。仔细收集 上清。检测细胞内的 成份时,用 PBS ( PH7.2-7.4 )稀释细胞悬液,细胞浓度达到 100 万 /ml 左右。通过反复冻融,以使细胞破坏并放出细胞内成份。离心 20 分钟左右( 2000-3000 转 / 分)。仔细收集上清。保存过程中如有沉淀形成,应再次离心。
5)细胞:
检测细胞的成份时,对于贴壁细胞,去除培养液,用PBS、理盐水或无血清培养液洗一遍。加 入适量裂解液。用枪吹打数下,使裂解液和细胞充分接触。通常裂解液接触细胞10 秒后,细胞 就会被裂解。对于悬浮细胞,离心收集细胞,用PBS、理盐水或无血清培养液洗一遍.加入适 量裂解液, 用枪吹打把细胞吹散。用手指轻弹以充分裂解细胞。充分裂解后应没有明显的细胞沉 淀。如果细胞量较多,必需分装然后再裂解。充分裂解后,10000-14000g离心3-5 分钟,取上 清,即可进行后续操作。
6)组织标本:
切割标本后,称取重量。加入一定量的 PBS 或组织蛋白萃取试剂,缓冲液中可加入蛋白酶抑制 剂。用手工或匀浆器将标本匀浆充分。离心 20 分钟左右( 2000-3000 转 / 分)。仔细收集 上清置于 -20 度或 - 70 度保存,如有必要,可以将样品浓缩干燥。分装后一份待检测,其余冷冻备用。
实验测定具体步骤:
1.确定本次检测所需的已包被抗体的酶标板孔数目,并增加 1 孔作为 TMB 空白显色孔。 总数=样品数+9;做双份检测时×2。其余重包装好放如冰箱中。
2.将标准品各 0.1ml 依次加入一排 7 孔中,1 孔只加样品稀释液的作为零孔。对于血清、体液、 组织匀浆或细胞培养上清,直接加已用样品稀释液稀释的样品 100μ ι 。
3.酶标板加上盖,37℃反应 90 分钟。
4.反应后用自动洗板机吸去酶标板内的液体;或甩去酶标板内液体,再对着吸水纸拍几下。 不洗。
5.将准备好的生物素抗体工作液按每孔 0.1ml 依次加入。(TMB 空白显色孔除 外)。37℃反应 60 分钟。
6. 0.01M TBS 或 0.01M PBS 洗涤 3 次,每次浸泡 1 分钟左右。
7.将准备好的 ABC 工作液按每孔 0.1ml 依次加入(TMB 空白显色孔除外)。37℃反应 30 分钟。
8. 0.01M TBS 或 0.01M PBS 洗涤 5 次,每次浸泡 1-2 分钟左右。
9.按每孔 90μ ι 依次加入已在 37℃平衡 30 分钟的 TMB 显色液,37℃避光反应 20-25 分钟 (注意:显色时间供参考,因用户实验室条件差异,显色时间会有所不同。此时肉眼可 见标准品的前 3-4 孔有明显的梯度蓝色,后 3-4 孔差别不明显)。
10.按每孔 0.1ml 依次加入 TMB 终止液,此时蓝色立转黄色。
11.用酶标仪在 450nm 测定 OD值。
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